Bakteri gram negatif dan positif mempunyai perbedaan pada hal hal berikut kecuali

Teknik Pewarnaan Gram general_alomedika 2020-06-11T18:08:26+07:00 2020-06-11T18:08:26+07:00

Teknik pewarnaan Gram dimulai dari pengambilan spesimen, kemudian dilanjutkan dengan persiapan apusan, pewarnaan Gram, dan pemeriksaan slide di bawah mikroskop. Bakteri Gram positif memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal (20-80 nm), sehingga akan mengambil kompleks stain-mordant primer dan akan tampak biru atau ungu di bawah mikroskop. Sementara itu, bakteri Gram negatif memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis (1-3 nm) dan persentase ikatan silang yang rendah diikuti dengan lapisan membran luar yang tipis (7-8 nm), sehingga tidak mengikat kompleks stain-mordant dan akan tampak merah di bawah mikroskop.[1]

Persiapan Pasien

Persiapan pasien bergantung pada jenis sampel yang diambil. Beberapa jenis sampel yang dapat diambil antara lain sampel darah, biopsi jaringan, cairan serebrospinal, cairan sinovial, lavase bronkoalveolar, sputum, nanah, duh tubuh, dan urin.[2,8,9]

Peralatan

Peralatan yang perlu dipersiapkan dalam melakukan pewarnaan Gram antara lain:

Mikroskop cahaya
Kaca objek
Pipet
Api bunsen
Kertas saring
Inoculation loop
Minyak imersi

Bahan-bahan yang diperlukan dalam melakukan pewarnaan Gram antara lain:

Sampel yang akan diperiksa
Cairan pewarna: larutan gentian violet atau kristal violet
- Larutan A: kristal violet 2 g, etanol 95% 20 ml
- Larutan B: ammonium oksalat 0,8 g, air steril 80 mL
Mordant larutan iodin Gram: iodin 1 g, potassium iodida 2 g, air steril 300 ml
Zat dekolorisasi (peluntur): etanol 95% 50 ml atau aseton 50 ml
Counterstain:
- Stock solution: safranin O 2,5 g, etanol 95% 100 ml
- Working solution: stock solution 10 ml, air steril 90 mL[1]

Prosedural

Prosedur pewarnaan Gram terdiri dari persiapan apusan, pewarnaan Gram, dan pemeriksaan di bawah mikroskop.

Persiapan Apusan

Cara mempersiapkan apusan yang akan diwarnai adalah :

Sterilkan inoculating loop pada api bunsen hingga memerah, kemudian tunggu dingin selama sekitar 30 detik. Jika loop masih panas saat spesimen diambil, sel bakteri bisa rusak
Dengan menggunakan kaca objek (slide) bersih, letakkan spesimen di tengah kaca objek. Jika spesimen diambil dari agar plate, beri 1 tetes air untuk membuat suspensi terlebih dulu
Dengan menggunakan inoculating loop, apuskan spesimen di atas kaca objek sampai didapatkan lapisan yang tipis, kemudian keringkan di udara
Panaskan kaca objek dengan melewatkannya di atas api bunsen sebanyak 2-3 kali agar terfiksasi[1]

Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram dilakukan dengan cara :

Tuangkan cairan pewarna kristal violet pada preparat secara merata, tunggu selama 1 menit
Miringkan preparat dan bilas dengan sedikit air mengalir
Tuangkan cairan mordant pada preparat, tunggu selama 1 menit
Miringkan kembali preparat dan bilas dengan sedikit air mengalir
Lakukan dekolorisasi dengan cara meneteskan cairan dekolorisasi sedikit demi sedikit pada preparat hingga tidak ada zat warna yang mengalir keluar dari preparat
Bilas preparat dengan air mengalir
Tuangkan counterstain (safranin) pada preparat, tunggu selama 30 detik sampai 1 menit
Bilas preparat dengan air mengalir, kemudian keringkan preparat
Lakukan pengamatan preparat menggunakan mikroskop dengan perbesaran 100 kali, 400 kali, hingga 1000 kali[4,10]

Kesalahan dalam Prosedur Pewarnaan Gram

Terdapat beberapa kesalahan yang dapat terjadi saat melakukan prosedur pewarnaan gram, antara lain:

Pemanasan berlebihan saat fiksasi
Preparat terlalu tebal
Larutan kristal violet konsentrasi rendah
Pencucian berlebihan dengan air (sebaiknya tidak lebih dari 5 detik)
Iodin yang kurang. Semakin rendah konsentrasi iodin yang digunakan, semakin mudah dekolorisasi terjadi
Dekolorisasi yang terlalu lama dengan etanol
Counterstaining terlalu banyak dan terlalu lama[2]

Interpretasi

Pada akhir prosedur pewarnaan gram, dilakukan interpretasi dari preparat. Bakteri Gram positif akan berwarna biru atau ungu, contohnya Staphylococcus sp dan Streptococcus sp. Bakteri Gram negatif akan berwarna merah atau merah muda, contohnya E.coli dan Salmonella typhi. Fungi seperti Candida dan Cryptococcus dapat juga diperoleh pada pemeriksaan Gram.[4]

Beberapa jenis bakteri memiliki sifat Gram variabel, di mana dapat terlihat campuran sel berwarna ungu dan merah muda. Genus bakteri Actinomyces, Arthrobacter, Corynebacterium, Mycobacterium, dan Propionibacterium memiliki dinding sel yang rentan mengalami kerusakan saat pembelahan sel, sehingga dapat memiliki tampilan Gram negatif. Bakteri Bacillus, Butyrivibrio, dan Clostridium memiliki penurunan ketebalan peptidoglikan dalam perkembangannya, sehingga beberapa sel akan terlihat Gram negatif.[10] Gardnella memiliki dinding sel Gram positif yang berbeda, sehingga menyebabkan hasil pewarnaan menjadi Gram negatif atau Gram variabel.[4]

Follow up

Setelah prosedur selesai dilakukan, hasil dilaporkan berdasarkan standard operating procedures (SOP) laboratorium setempat. Hasil yang signifikan kemudian dapat dilaporkan pada ahli patologi atau dokter penanggung jawab pasien. Hasil pewarnaan Gram dapat membantu dokter menentukan diagnosis awal dan pemilihan antibiotik, sambil menunggu hasil kultur dan sensitivitas antibiotik.[2]

1. Moyes RB, Reynolds J, Breakwell DP. Differential Staining of Bacteria: Gram Stain. Current Protocols in Microbiology, 2009. doi:10.1002/9780471729259.mca03cs15 2. Thairu Y, Nasir IA, Usman Y. Laboratory perspective of gram staining and its significance in investigations of infectious diseases. Sub-Saharan Afr J Med 2014;1:168-74 4. Smith AC, Hussey MA. Gram Stain Protocols. American Society for Microbiology, 2005. https://www.asm.org/getattachment/5c95a063-326b-4b2f-98ce-001de9a5ece3/gram-stain-protocol-2886.pdf 8. O’Horo JC, Thompson D, Safdar N. Is the Gram Stain Useful in the Microbiologic Diagnosis of VAP? A Meta-analysis. Clin Infect Dis. 2012 Aug 15;55(4):551–61. 9. Kaftandzieva A, Cekovska Z, Kaftandziev I, Petrovska M, Panovski N. Bacteriology of Wound - Clinical Utility of Gram Stain Microscopy and the Correlation with Culture. Macedonian Journal of Medical Sciences. 2012 Mar 1;5(1):72–7.

10. Jain A, Jain R, Jain S. Staining Methods – Simple Staining, Negative Staining, Gram’s Staining and Acid-Fast Staining. In: Jain A, Jain R, Jain S, editors. Basic Techniques in Biochemistry, Microbiology and Molecular Biology: Principles and Techniques. New York, NY: Springer US; 2020. p. 111–6. (Springer Protocols Handbooks). Available from: https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9861-6_31

Gram-positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan Gram sehingga akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop.[1]

Bakteri gram positif Bacillus anthracis (batang ungu) pada cairan serebrospinal. Sel yang lain adalah sel darah putih.

Disisi lain, bakteri gram-negatif akan berwarna merah atau merah muda.[1] Perbedaan keduanya didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel yang berbeda dan dapat dinyatakan oleh prosedur pewarnaan Gram.[2] Prosedur ini ditemukan pada tahun 1884 oleh ilmuwan Denmark bernama Christian Gram dan merupakan prosedur penting dalam klasifikasi bakteri.[3]

Bakteri gram positif seperti Staphylococcus aureus (bakteri patogen yang umum pada manusia) hanya mempunyai membran plasma tunggal yang dikelilingi dinding sel tebal berupa peptidoglikan.[2] Sekitar 90 persen dari dinding sel tersebut tersusun atas peptidoglikan sedangkan sisanya berupa molekul lain bernama asam teikhoat.[1] Di sisi lain, bakteri gram negatif (seperti E. coli) memiliki sistem membran ganda di mana membran pasmanya diselimuti oleh membran luar permeabel.[2] Bakteri ini mempunyai dinding sel tebal berupa peptidoglikan, yang terletak di antara membran dalam dan membran luarnya.[2]

Berikut ini adalah karakteristik dari bakteri Gram positif dan negatif. Prescott LM, Harley JP, Klein DA. 2002. Microbiology. 5th Ed. Boston: McGraw-Hill.

Karakteristik	Gram positif	Gram negatif
Dinding sel	Homogen dan tebal (20-80 nm) serta sebagian besar tersusun dari peptidoglikan. Polisakarida lain dan asam teikoat dapat ikut menyusun dinding sel.	Peptidoglikan (2-7 nm) di antara membran dalam dan luar, serta adanya membran luar (7-8 nm tebalnya) yang terdiri dari lipid, protein, dan lipopolisakarida
Bentuk sel	Bulat, batang, atau filamen	Bulat, oval, batang lurus atau melingkar seperti tanda koma, heliks atau filamen; beberapa mempunyai selubung atau kapsul
Reproduksi	Pembelahan biner	Pembelahan biner, kadang-kadang pertunasan
Metabolisme	kemoorganoheterotrof	Fototrof, kemolitoautotrof, atau kemoorganoheterotrof
Motilitas	Kebanyakan nonmotil, bila motil tipe flagelanya adalah petritrikus (petritrichous)	Motil atau nonmotil. Bentuk flagela dapat bervariasi-polar, lopotrikus (lophtrichous), petritrikus (petritrichous).
Anggota tubuh (apendase)	Biasanya tidak memiliki apendase	Dapat memiliki pili, fimbriae, tangkai
Endospora	Beberapa grup dapat membentuk endspora	Tidak dapat membentuk endospora

Peptidoglikan (murein) adalah komponen utama dinding sel bakteri yang bersifat kaku dan bertanggungjawab untuk menjaga integritas sel serta menentukan bentuknya.[4]
Protoplas adalah sel yang telah dihilangkan dinding selnya dan karena suatu sel hidup di lingkungan hipotonis (lebih encer dibanding sitoplasma sel) maka kecenderungannya air akan masuk ke dalam sel sehingga protoplas yang tidak memiliki perlindungan dinding sel akan pecah.[4]
Peptdoglikan adalah polisakarida yang terdiri dari dua gula turunan yaitu asam-N-asetil glukosamin serta asam N-asetilmuramat, dan sebuah rantai peptida pendek yang contohnya terdiri dari asam amino l-alanin, d-alanin, d-asam glutamat, dan baik l-lisin atau asam diaminopimelik (DAP).[4]
DAP adalah asam amino langka yang hanya ditemukan pada dinding sel prokariot.[4]

Untuk keterangan lebih lanjut dapat dilihat pada gambar di bawah ini.

Skema dinding sel bakteri gram positif

Berikut ini adalah klasifikasi dari bakteri Gram positif.

Berikut ini adalah penyakit-penyakit yang dapat ditimbulkan bakteri Gram positif dan negatif.[4]:

Gram	Genus	Penyakit
Gram positif	Staphylococcus Streptococcus Enterococcus Listeria Bacillus Clostridium Mycobacterium Propionibacterium Mycoplasma	impetigo, keracunan makanan, bronkitis pneumonia/radang paru, meningitis, karies gigi enteritis listeriosis anthrax tetanus, botulisme difteri tuberkulosis jerawat pneumonia
Gram negatif	Salmonella Escherichia Shigella Neisseria Bordetella Legionella Pseudomonas Vibrio Campylobacter Helicobacter Haemophilus Treponema Chlamydia	salmonelosis gastroenteritis/radang saluran cerna disentri meningitis, gonorea batuk rejan legionnaires' disease infeksi luka bakar kolera gastroenteritis tukak lambung bronkitis, pneumonia sifilis pneumonia, uretritis, trakoma

Bakteri
Pewarnaan Gram
Gram-negatif
Peptidoglikan

^ a b c Madigan MT, Martinko JM, Brock TD. 2006. Brock Biology of Microorgnisms. New Jersey: Pearson Prentice Hall.
^ a b c d Cooper GM, Hausman RE. 2007. The Cell: A Molecular Approach. 4th ed. Sunderland: Sinauer Associates, Inc.
^ Singleton P, Sainsbury D. 2006. Dictionary of Microbiology and Molecular Biology. New Jersey: Wiley Interscience.
^ a b c d e Hogg S. 2005. Essential Microbiology. West Sussex: John Wiley & Sons Ltd.